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发布时间:2020-03-12

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药物中杂质常以GC-FIDGC-ECDGC-MSHPLC-UVHPLC-MS进行分析检测,但是有些杂质在上述仪器中的灵敏度低,甚至无法满足检测要求;因此可以通过化学衍生化的方法提高其灵敏度或改变检测方式来满足检测要求。从而可以更好的对杂质进行控制,提供更安全的药品。

理想衍生化反应的特征:1)方便通用(反应试剂易得、稳定、条件温和);2)简单价廉(反应步骤简单且消耗少);3)快速进行(通常在15分钟以内完成);4)选择良好(不与非目标分析物作用);5)反应定量(与目标分析物的作用定量进行);6)产物单一(不额外生成与检测无关的物质)。

液相和气相色谱分离是常见的两种分离方法,因此,下面将主要介绍用于气相和液相的衍生技术。

气相衍生技术

一、硅烷类衍生试剂

胺基、巯基、羧基、羟基等的活泼氢可以被烷基硅基取代,可以利用此性质进行硅烷衍生化反应,从而使一些不易气化的杂质易于气化、或增强其热稳定性。常用的硅烷化试剂如有:三甲基硅烷(TMS)、三甲基氯硅烷(TMCS)、三乙基硅烷(TES)、N,N-二乙胺基二甲基硅烷(DADS)、叔丁基甲氧基苯基硅烷(TBMPS)、N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)、N-甲基-N-甲基硅三氟乙酰胺(MSTFA)、N-甲基硅二乙胺TMSDEA)、三甲基硅咪唑(TMSI)、N,O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)、N-(三甲基硅基)二甲胺(TMSDMA)、N-甲基-N-(三甲基硅基)乙酰胺(MSA)、六甲基二硅氮烷HMDS)等,溶剂为非质子溶剂,如二甲基亚砜和四氢呋喃等。硅烷类衍生试剂的反应活性:醇 > > 羧酸> > 酰胺。

二、卤代烷类衍生试剂

取代化合物与带有活泼氢的化合物(如羟基、羧基等)进行烷基化反应,常见的卤代

烷类衍生试剂包括卤代脂肪烷烃、卤代α-卤代羰基化合物等。

三、重氮烷类衍生试剂

衍生化试剂举例:重氮甲烷、重氮乙烷、重氮丙烷、重氮甲苯等。

四、醇类衍生试剂

衍生化试剂举例:甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇;需用催化剂,常见催化剂为盐酸、硫酸、BF3BCl3或酸酐

五、酸酐类衍生试剂

    衍生化试剂举例:乙酸酐(AA)、苯甲酸

六、可引入卤素的衍生试剂

1)卤代酸酐法(三氟乙酸酐(TFA、五氟丙酸酐(PFP)、七氟丁酸酐(HFB)

2)酰卤类试剂(乙酰氯、苯甲酰氯)

3)卤代烷基酰胺(N-甲基双三氟乙酰胺)(MBTFA)

4)卤代酰基咪唑(三氟乙酰咪唑(TFAI)、七氟丁酰咪唑)

5)卤素加成或取代

6)卤化氢加成或取代

7N-溴代琥珀酰亚胺(NBS-Br)

 

七、四甲基铵盐热解法

     将羧酸溶于甲醇,以24%的氢氧化四甲基铵甲醇溶液滴定至酚酞变色,加热至350,得相应的羧酸甲酯。

可以结合杂质结构特性和检测器,选择合适的衍生化试剂。比如,需要提高

ECD灵敏度的,可以选择能引入卤素的衍生试剂;需要进行质谱检测的,可以引入易于离子化的基团(比如含氮基团)等。

液相衍生技术

在液相色谱法中,紫外吸收检测器是最常见的一种检测器。但很多化合物在紫外可见光谱区无吸收,无法检测。将它们与带有紫外吸收基团的衍生试剂在一定条件下发生反应,由于反应产物带有发色基团而能被检测。

能产生紫外吸收的物质应含有生色团:如C=CC=ON=NNO2C=S等基团,分子结构中如含有-OH-NH2-OR-SH-SR-Cl-Br-I等助色基团时,当它们与生色团相连,能使该生色团的吸收峰向长波方向移动,并使吸收强度增加。

荧光检测器是一种高灵敏度、高选择性的检测器,比紫外检测器的灵敏度要高10-1000倍,尤其适合痕量分析 能产生荧光的物质的分子结构具有大共轭结构,分子具有共平面性和刚性。

由于荧光检测器的灵敏度高,适合于微量、痕量杂质检测,因此,本综述对

荧光衍生试剂进行介绍。同气相衍生,可以结合杂质结构特性和检测器,选择合适的衍生化试剂。

液相色谱——质谱联用技术(LC-MS)是20世纪70年代发展起来的一门新的仪器分析方法,是一种以液相色谱为主要分离手段,质谱法作为检测手段的色谱检测技术,集合了液相色谱仪的高分离能力和质谱仪的高灵敏度、高专属性的特点,简化了复杂混合物的分离纯化过程。LC-MS技术已经成为药物中微量杂质分析的首选技术,特别是多级质谱和高分辨质谱的发展和应用,能够在线获得化合物的丰富片段信息和分析组成信息,可根据一级、二级甚至多级质谱信息确定化合物的分子量并推断出可能分子结构,为药物杂质的结构鉴定提供快速、准确的方法。

一、胺基的衍生化反应

胺的化学性质与其原子上两个未成对的电子有关。具有亲核性,能与亲电

性化合物发生反应,容易与卤代烃、羰基、酰基化合物、酸等发生反应,因此,这些化合物经常作为胺类的衍生化试剂。

1)酰卤类衍生试剂

紫外衍生试剂:对硝基苯甲酰氯、3,5-二硝基苯甲酰氯、对甲氧基苯甲酰氯

荧光衍生试剂:9-芴氯(FMOC)、34-二氢-67-二甲氧基—4-甲基-3-喹恶啉-2-羰酰氯(DMMQC-Cl)、6-甲氧基-2-甲基磺酰-喹啉-4-羰酰氯(MSQC-Cl)等。

2)磺酰卤类衍生试剂

    荧光衍生试剂:丹酰氯DNS-Clp-44-二甲氨基偶氮苯酰氯(DABS-Cl)、55-二丁氨基-1-萘磺酰氯(BNS-Cl)、N-甲基-2-苯胺基-6-酰氯、4--1-偶氮-4-二甲氨基苯)酰氯、香豆素-6-酰氯(C-6-SO2Cl)。

3)硫代酰卤类衍生试剂

4)活性卤类衍生试剂

紫外衍生试剂举例:2,4-二硝基氟苯(FDNB)、

荧光衍生试剂:4--7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑 NBD-Cl)、NBD-FNBD-BrDBD-FABD-FSBD-F等。

5)氯甲酸酯类衍生试剂

6)芳香邻二醛类衍生试剂

荧光衍生试剂:邻苯二甲醛(OPA)、23-二醛(NDA)、3-2-呋喃甲酰基)-喹啉-2-醛(FQCA)、3-4-羧基苯甲酰基)-喹啉-2-醛(CBQCA

7N-氧取代琥珀酰亚胺类衍生试剂

紫外衍生试剂: N-琥珀酰亚胺对硝基苯乙酸酯。

荧光衍生试剂:6-氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯(AQC)、SIIAFL-O-Ac-SEBODIPY-C3-SEFMOC-SE

8)异硫氰酸酯类衍生试剂

紫外衍生试剂:异硫氰酸苯酯

荧光衍生试剂:异硫氰酸苯酯、4-N,N-对二甲胺基偶氮苯-4ˊ-异硫氰酸酯(DABITC )、4-56-二甲氧基苯并噻唑)苯异硫氰酸酯、荧光素异硫氰酸酯(FITC

9)其他

紫外衍生试剂:三酮

二、羟基的衍生化反应

1)酰卤类衍生试剂

紫外衍生试剂:对硝基苯甲酰氯、3,5-二硝基苯甲酰氯、对甲氧基苯甲酰氯等。

荧光衍生试剂:9-芴甲氧基羰酰氯(FMOC)、9-芴乙氧基羰酰氯(CEOC)、

2)磺酰卤类衍生试剂

荧光衍生试剂:DNS-Cl2-芴磺酰氯、丹磺酰氯

3)卤代三嗪类

    荧光衍生试剂:1-乙氧基-4-(二氯-S-三嗪)萘(EDTN

4)羰基氰类

    荧光试剂:-1-羰基

5)苯基异硫氰酸酯类衍生化试剂

三、羧基的紫外衍生

1)重氮甲烷类

荧光衍生试剂:9-蒽重氮甲烷(ADAM)、1-芘重氮甲烷

2)α-溴代羰基化合物类

    紫外衍生试剂:4-溴甲基-7-甲氧基香豆素、苯甲酰溴、萘甲酰溴、甲氧基苯甲酰溴、对溴基苯甲酰溴、对硝基苯甲酰溴等

3)烯丙基溴类

        荧光衍生试剂:4-溴甲基-7-甲氧基香豆(BrMMC

4)哌嗪基类

        荧光衍生试剂:7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃(DBD-PZ

5)磺酸酯类

6)其他

荧光衍生试剂:9-(2-羟乙基)-吖啶酮 HEA4-氨甲基-67-二甲基香豆素 (ADMC)

四、羰基化合物的反应

含有(NH2-NH2)或胺基(-NH2)的化合物易与含有醛基和酮基的化合物发生缩合反应,分别生成相应的和席夫碱化合物。因此,NH2-NH2 -NH2可以作为羰基化合物衍生试剂的活性基团。

1)肼类化合物

   紫外衍生试剂:2,4-二硝基苯肼(DNPA)、

   荧光衍生试剂:DNs-HCEOC-H

2)  胺类化合物

紫外衍生试剂举例:对硝基苄基羟胺

          荧光衍生试剂:氨基甲基芘

 

 

五、巯基化合物

1)碘乙酰胺类

2)马来酰亚胺

3)苄基卤化物

4)溴甲基酮

    本综述未对详细的反应条件进行一一列举,读者可以根据需求查阅文献确定相关试验方案。